Кишечную палочку научили встраиваться в клетку дрожжей и работать митохондрией

Рис. 1. Снимок химерных клеток кишечной палочки и дрожжей, сделанный с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. Голубым окрашены клетки дрожжей, фиолетовым — РНК кишечной палочки. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Общепринятая на данный момент теория симбиогенеза предполагает, что митохондрии в эукариотических клетках произошли от симбиотических бактерий. Однако поиски предковой бактерии и реконструкция событий симбиогенеза еще далеки от завершения. Авторы новой статьи в журнале PNAS подошли к проблеме с другого конца: они смоделировали симбиогенез на примере хорошо изученной бактерии (Escherichia coli) и хорошо изученной эукариотической клетки (Saccharomyces cerevisiae). Теперь у нас есть отработанная методика получения химерных клеток, с помощью которой можно проверять, какие именно свойства предковой бактерии были необходимы для симбиогенеза.

Теория симбиогенеза была предложена в 1967 году. Согласно ей, археи и протеобактерии вступили в эндосимбиоз (первые тем или иным способом «поглотили» вторых), что привело к возникновению эукариот (см.: Теория симбиогенеза 50 лет спустя: параллельной эукариотизации, скорее всего, не было, «Элементы», 22.11.2017). За 50 лет удалось уточнить разные детали: судя по всему, эндосимбиоз с предками митохондрий произошел только один раз, а не в нескольких параллельных ветвях, и это стало конечным этапом в становлении эукариот (см.: Генеалогия белков свидетельствует о позднем приобретении митохондрий предками эукариот, «Элементы», 08.02.2016). Однако вопросов всё еще остается немало: например, что это была за предковая бактерия? Одна из распространенных точек зрения заключается в том, что изначально бактерии паразитировали на клетках архей, а потом паразитизм перешел в симбиоз. В таком случае, ближайшие родственники такой бактерии, известные нам, — это альфапротеобактерии риккетсии, внутриклеточные паразиты многих животных и человека (вызывают, например, эпидемический сыпной тиф и пятнистую лихорадку Скалистых гор).

Можно продолжать поиск родственников «с конца», то есть сравнивать геномы современных митохондрий с геномами различных бактерий и искать пересечения, а можно зайти «с начала» и попробовать воспроизвести эту предковую бактерию самим. Для этого нужно определить минимальный набор свойств, которыми она должна обладать для успешного внедрения внутрь археи. Заодно такой метод мог бы пролить свет на последовательность событий симбиогенеза. Но коль скоро мы не умеем создавать бактерии с нуля, можно модифицировать самую изученную бактерию на свете — кишечную палочку (Escherichia coli).

Общий принцип, которым руководствовались авторы эксперимента, можно сформулировать так: чтобы заставить две клетки вступить в симбиоз, нужно отобрать у них что-то жизненно важное, тогда их существование по отдельности станет невозможно (рис. 2).

Кишечную палочку научили встраиваться в клетку дрожжей и работать митохондрией

Рис. 2. Дизайн эксперимента. А — нормальный обмен веществ в клетке дрожжей: глюкоза расщепляется в ходе гликолиза с образованием АТФ. Другие органические вещества, в частности глицерин, расщепляются в ходе цикла Кребса в митохондриях с образованием АТФ. В — химерная клетка. В питательной среде нет глюкозы, есть только глицерин, но собственные митохондрии дрожжевой клетки не работают. Добыть энергию из глицерина может только клетка E. coli, которая, в свою очередь, получает от «хозяина» витамин B1. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Всю работу можно условно разделить на пять шагов.

Шаг 1 — лишить кишечную палочку самодостаточности. Чтобы эндосимбиоз оказался выгодным решением для бактерии, она должна стать ауксотрофом — быть неспособной производить какое-нибудь жизненно необходимое вещество. Для многих бактерий таким веществом является тиамин (витамин B1) — кофермент в реакциях углеводного обмена. Поэтому в геноме E. coli ген биосинтеза тиамина был заменен на кассету (см. Gene cassette) с GFP (зеленым флуоресцентным белком) и геном устойчивости к антибиотику канамицину. Теперь клетки не могут выживать без внешнего источника тиамина (который они сквозь мембрану закачивают внутрь), их можно отобрать под действием антибиотика и отследить во флуоресцентный микроскоп.

Шаг 2 — сделать кишечную палочку полезной. Авторы гипотезы происхождения митохондрии из внутриклеточных паразитов полагают, что одним из ключевых белков был АТФ/АДФ-антипортер (см. Antiporter). Это белок-переносчик, который обменивает АТФ на АДФ, меняя их местами по разные стороны мембраны. У паразитической бактерии он должен работать на благо бактерии: захватывать АТФ снаружи (то есть отбирать у клетки-хозяина) и менять на отработанные АДФ бактерии. Однако этот механизм можно заставить работать и в обратную сторону, если концентрации веществ поменяются местами. При этом бактерия начнет забирать АДФ из цитоплазмы хозяина и отдавать АТФ. Так или иначе, АДФ/АТФ-антипортеры есть как у современных митохондрий, так и у внутриклеточных паразитов. У свободно живущей кишечной палочки такого белка нет, поэтому пришлось снабдить клетки E. coli плазмидой с соответствующим геном.

Шаг 3 — лишить дрожжи самодостаточности. Чтобы заставить дрожжи вступить в симбиоз, их нужно лишить энергии, то есть АТФ. Тогда единственным выходом будет получить его от кишечной палочки. Но у дрожжей, как у почти всех эукариот, есть свои митохондрии. Поэтому авторы эксперимента взяли мутантный штамм дрожжей, лишенный одного из ключевых митохондриальных генов. Такие клетки содержат митохондрии, но не получают от них энергии. Они не могут расти в среде, где из питательных веществ есть только глицерин. Однако оказалось, что и в симбиоз с E. coli они тоже не вступают.

Шаг 4 — добавить «белки слияния». Эукариотическая клетка — это множество вложенных друг в друга мембранных пузырьков. Чтобы органеллы хаотично не сливались друг с другом, мембраны покрыты белками группы SNARЕ, которые могут стимулировать или блокировать слияние. Многие патогенные бактерии тоже несут SNARE-подобные белки. Клетка-хозяин воспринимает их как собственные органеллы и не переваривает (то есть с ними не сливаются лизосомы). Правда, мы пока не уверены в том, что к моменту эндосимбиоза эукариоты уже обладали системой этих белков. Но коль скоро мы работаем с дрожжами, приходится на нее ориентироваться. Авторы эксперимента ввели кишечной палочке гены трех разных SNARE-подобных белков, позаимствованных у хламидий. И только после этого они получили устойчивые колонии дрожжей с симбиотическими E. coli (рис. 3). Колонии росли на среде, богатой глицерином, лишенной тиамина и с добавлением антибиотика канамицина, — то есть удовлетворяли всем условиям эксперимента. В том же составе химерные клетки размножались в течение последующих трех дней культивирования, что соответствует примерно 40 делениям.

Кишечную палочку научили встраиваться в клетку дрожжей и работать митохондрией

Рис. 3. Ультраструктура химерных клеток: результаты томографии под действием мягкого рентгеновского излучения. Сверху вниз — три плана в разных плоскостях. Левый столбец — просто снимок, средний столбец — снимок с выделенными органеллами, правый столбец — реконструкция клетки с обозначением плоскости среза (пунктирная линия). Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Шаг 5 — убрать лишнее. В ходе эволюции митохондрия утратила большую часть ДНК (у млекопитающих, например, в ее геноме осталось лишь 37 генов). Это значит, что она становилась всё более зависимой от своей клетки-хозяина. Авторы обсуждаемой статьи попробовали воспроизвести и этот этап тоже. Для этого они удалили у клеток кишечной палочки ген биосинтеза НАД+ — еще одного важного кофермента. Клетки, лишенные НАД+, так же как и их предшественники, лишенные тиамина, успешно образовывали химеры с дрожжами. И даже двойные мутанты, неспособные производить ни один из этих коферментов, также вступали в эндосимбиоз (рис. 4).

Кишечную палочку научили встраиваться в клетку дрожжей и работать митохондрией

Рис. 4. Колонии химерных клеток, образованные разными штаммами кишечной палочки. А. Слева направо: контроль (клетки дрожжей), длина масштабного отрезка 10 мкм; химера с E. coli, дефицитными по тиамину, длина масштабного отрезка 5 мкм; химера с E. coli, дефицитными по НАД+; химера с E. coli, дефицитными по обоим коферментам. Зеленым светится GFP в клетках кишечной палочки. В. Слева направо: контроль, химера с E. coli, дефицитными по тиамину и по НАД+. Дрожжи окрашены голубым (краситель FITC), бактерии — фиолетовым зондом, связывающимся с бактериальной РНК. Желтые стрелки указывают на примеры химерных клеток. Длина масштабного отрезка 10 мкм. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Перед нами — отработанная методика, с помощью которой можно моделировать ранние события эндосимбиоза. Клетки кишечной палочки, дефицитные по разным веществам, равно хорошо образуют химеры, которые воспроизводятся из поколения в поколение. Следующий шаг — поиск предельной редукции генома E. coli, возможной в данной ситуации. Авторы статьи отмечают, что удаление всего двух путей биосинтеза уже дало экономию в 7,7 тысяч пар нуклеотидов (для сравнения, весь митохондриальный геном человека составляет примерно 15 тысяч пар). Поэтому нам еще предстоит найти ту грань, на которой экономия размера генома столкнется с возможностью выживания клетки-симбионта.

Кроме того, как ехидно указывают авторы в конце текста, при таком раскладе не очень понятно, кто в этой истории настоящий паразит. Если бактерия, попавшая внутрь археи, лишь постепенно утрачивала свои метаболические пути, то возможно настоящим паразитом здесь стоит считать архею, которая потребляла энергию, производимую бактерией.

Источник: elementy.ru

22 КОММЕНТАРИИ

  1. I have been browsing on-line more than 3 hours these days,
    yet I by no means discovered any attention-grabbing article
    like yours. It’s pretty worth enough for me. Personally, if all
    webmasters and bloggers made just right content as you did, the web
    might be much more helpful than ever before. I just
    could not leave your site before suggesting that I
    really enjoyed the standard info an individual supply in your visitors?
    Is gonna be again incessantly to investigate cross-check new posts
    I have been surfing online more than 3 hours
    today, yet I by no means discovered any interesting
    article like yours. It is lovely worth sufficient for me.

    Personally, if all website owners and bloggers made excellent content as you did, the net might be
    much more useful than ever before. http://foxnews.co.uk

  2. I loved as much as you’ll receive carried out right
    here. The sketch is tasteful, your authored subject matter stylish.
    nonetheless, you command get got an shakiness over that you
    wish be delivering the following. unwell unquestionably come more formerly again as
    exactly the same nearly a lot often inside case
    you shield this increase.

  3. Ever see should have a message page. Websites
    ranging in proportions and class coming from a local restaurant to your Fortune 500 company, have contact pages.
    At my current startup I’ve seen an array of requests… with the
    pizza delivery guy letting us know he was in the door
    to potential investors looking to communicate with our management team.

    When you find yourself setting encourage contact page (and getting the traffic
    volume on the local restaurant) you may not be considering how to
    deal with your contact requests when site traffic increases.
    However you should.

    Think about configuring automation that alerts support, sales
    and other stakeholders as part of your company when a message request comes
    through. You can create a dropdown field in an application form for sorts of
    contact requests. You possibly can set up logic practically in most marketing automation platforms that sends email alerts to the
    appropriate resource in the startup based upon what sort of request the
    viewer selects.

    I had been buried with contact requests when we launched beta.

    As being a cloud-based product I saw many product support requests.

    So we mapped form submissions on our contact page to develop support tickets in Zendesk.

    You need to set up redundancies so contact requests (important ones!) don’t explore one particular recipient’s inbox.

    It is possible to alert multiple recipients, create reminder emails, or trigger automatic replies to contact requests with information that could solve
    their problem. This is perhaps all quite simple to create with all-in-one marketing platforms like HubSpot.

  4. You actually make it seem really easy along with your presentation however I find this matter
    to be really something which I believe I’d by no means understand.

    It seems too complicated and extremely huge for me.
    I’m taking a look forward to your next submit, I’ll
    try to get the hold of it!

  5. Having read this I thought it was really enlightening. I appreciate you taking the time
    and energy to put this article together. I once again find myself personally spending
    way too much time both reading and posting
    comments. But so what, it was still worth
    it!

  6. My coder is trying to persuade me to move to .net from PHP.

    I have always disliked the idea because of the expenses.

    But he’s tryiong none the less. I’ve been using Movable-type
    on numerous websites for about a year and am concerned about switching to another platform.
    I have heard very good things about blogengine.net.

    Is there a way I can import all my wordpress content into it?
    Any kind of help would be really appreciated!

  7. Hello there, I found your website via Google even as looking for a similar
    matter, your website got here up, it appears good.
    I’ve bookmarked it in my google bookmarks.

    Hello there, simply become alert to your weblog
    thru Google, and located that it’s really informative. I’m going to be careful for brussels.
    I’ll be grateful if you continue this in future. A lot
    of folks shall be benefited from your writing. Cheers!

  8. I’m glad I stumbled upon your article about choosing an HVAC contractor.

    I absolutely agree that stability in the business of the contractor is a fantastic
    sign that this contractor is doing a superb job.
    Yes, HVAC system is definitely the just about the most expensive equipment that my hubby bought for our home, so it will be important
    given our budget to only make use of a reputable HVAC company.
    Our heating system will not produce enough heat anymore, of which this is causing many discomfort included in the house.
    I’m looking to find a contractor that has elevated the business for long periods because for folks, their experience with handling repairs are extensive and reliable.
    I’ll ensure you consider the necessary useful information on HVAC contractor.

  9. «We will need to build to a different one crescendo, cheri,» he said.
    «And we all will have an ending that might be as none before.»

    His smile was decadent, his eyes were filled up with
    lust, plus the soft skin of his hard cock against my sex was
    having its intended effect. I’d been feeling a stronger arousal
    now as I felt his cock slide between my sensitive lips.
    I felt your head of his cock push agonizingly at the entrance of my pussy,
    and I needed him to thrust into me hard.
    Instead he pulled back and slid his hardness back as much as
    my clit.

    I used to be aching to possess him inside, and I possibly could
    tell that his must push that wonderful hard cock inside me was growing.
    His moans grew to suit mine, and I knew the sense of
    my wet pussy lips around the head of his cock was getting a lot of both
    for of us.

    «Allow the finale begin,» he explained, and hubby slid the end of his cock inside me.

    The two of us gasped because held his cock there for just a moment.
    I contracted my pussy to pull him further inside, and he threw his head back in the sensation.
    Inch by excruciating inch he pushed his cock inside me, and each time I squeezed my pussy around him.
    His cock felt wonderful since it filled me, but Needed all of it
    inside me. I rolled sideways and rested my leg against his shoulder, anf the husband plunged
    his cock up in.

  10. Wonderful work! That is the kind of info that are meant to be
    shared across the web. Shame on the search engines for not positioning this submit higher!
    Come on over and visit my website . Thanks =)

  11. Have you ever thought about including a little bit more than just your articles?
    I mean, what you say is valuable and all. However think
    about if you added some great pictures or video clips to give your posts more,
    «pop»! Your content is excellent but with pics and video clips, this site could definitely be one of the best in its field.

    Fantastic blog!

  12. Attractive part of content. I simply stumbled upon your web site and
    in accession capital to assert that I get actually loved account your weblog posts.

    Anyway I will be subscribing in your augment and even I fulfillment you access constantly quickly.

  13. Hey there would you mind sharing which blog platform you’re using?

    I’m going to start my own blog soon but I’m having
    a difficult time choosing between BlogEngine/Wordpress/B2evolution and Drupal.
    The reason I ask is because your design and style seems different then most blogs and I’m looking for something
    unique. P.S Sorry for being off-topic but I had
    to ask!

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ

Please enter your comment!
Please enter your name here

десять − 2 =